图1 3H-TdR掺入检测类风湿关节炎
滑膜细胞中DNA合成
2.活化型MAPK的检测：一抗为抗活化形式细胞外信号调节激酶(ERK)的多克隆抗体(1∶20 000)、二抗为辣根过氧化物酶偶连驴或羊抗兔IgG(1∶10 000)，确定相对分子质量为42 000的ERK明显活化。用洗脱液洗脱抗活化形式ERK的多克隆抗体，在同一张硝酸纤维素滤膜用抗非活化形式的ERK抗体(1∶100)进行检测，对照组和刺激组非活化ERK1和ERK2几乎完全相同，说明刺激组和对照组蛋白上样量的一致性。综合两图结果，说明滑膜细胞中ERK在EGF和TNF-α的作用下明显活化。同样检测JNK和P38的活化情况，抗活化形式的一抗C-JunN端激酶(JNK)，(1∶5 000)、P38(1∶2 000)多克隆抗体，结果表明JNK和P38均未见活化。
三、讨论
RA滑膜中存在过量的细胞因子、受体和与其有同源性的癌基因产物，它们可能作用于滑膜细胞信号传导途径的不同部位，导致持续的信号传导，从而引起RA滑膜细胞的肿瘤样改变［2］。在滑膜组织中以自分泌和旁分泌的方式，大量表达EGF、TNF-α及其受体，EGF是强有力的促细胞分裂因子，TNF-α能诱导骨吸收及抑制蛋白多糖的合成，上调RA滑膜细胞分泌胶原酶、基质金属蛋白酶、环氧化酶、PGE2、细胞粘附分子和IL-1、IL-6、IL-8等［3］。我们应用体外培养RA滑膜细胞，加入外源性EGF和TNF-α刺激，观察对细胞增殖的影响，结果表明，EGF能显著诱导细胞的增殖，TNF-α对细胞的增殖无影响。但二者是否影响处于细胞内信号传导途径中重要中介位置的有丝分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)的活性呢？MAPK负责将特异细胞外刺激信号诱发的蛋白激酶酪氨酸磷酸化转变为蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而使信号向下游传导。ERK、JNK和P38都属于MAPK的亚型。ERK主要与细胞的增殖通路有关，而JNK和P38 在诱导细胞凋亡的信号传导途径中起作用。在未受刺激的细胞内，MAPK表现为脱磷酸型，只有当它的苏氨酸和酪氨酸残基都被磷酸化后，MAPK才被激活。3种亚型可以独立或同时被激活［4］。
既往检测MAPK的活化需要检测其对特异底物MAP-2(microtuble-associated protein 2)或MBP(myelin basic protein)的磷酸化情况，需同位素掺入和免疫沉淀等繁琐步骤［5］。而本实验所用最新出现的抗活化形式的抗体直接标记磷酸化的苏氨酸和酪氨酸残基，使实验步骤简单易行，并且避免了接触同位素。本实验表明EGF和TNF-α都能明显活化ERK，结合3H-TdR掺入的结果，我们推测EGF刺激后ERK通路的活化引起了滑膜细胞的增殖，TNF-α刺激后细胞中ERK的活化可能与促进滑膜细胞分泌炎性因子和炎性蛋白酶有关。ERK的活化在这两条通路中都起重要的作用。因本实验只是一个初步的研究，EGF 和TNF-α作用于RA滑膜细胞后引起MAPK激活的上、下游激酶及细胞内详细的信号传导途径尚需进一步实验证实。
基金项目：国家自然基金资助项目(39730430)
参考文献
1，Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988, 31: 315-324.
2，燕太强，吕厚山，药立波.类风湿关节炎滑膜细胞酪氨酸激酶信号传导系统.中华风湿病学杂志，1999，3：121-123.
3，陆华中，李崇渔，邹萍. TNF-α与TNF受体超家族介导的信号传导.国外医学分子生物学分册, 1997, 19: 105-109.
4，Cano E & Mahadevan LC. Parallel signal processing among mammalian mitogen-activated protein kinases. Trends Biochem Sci, 1995, 20: 117-122.
5，Dionne S, D'Agata ID, Ruemmele FM, et al. Tyrosine kinase and MAPK inhibition of TNF-α-and EGF-stimulated IEC-6 cell growth. Biochem Biophy Res Commun, 1998, 242: 146-150.
