抗原肽处理相关运载体等位基因多态性与类风湿关节炎相关性研究
沈冲 叶冬青 翟金霞 黄芬 施晓明 陆伟 李向培 2004-7-24 15:34:00 中华中西医杂志 2003年8月 第4卷 第16期
关键词：抗原肽
【摘要】 目的 探讨皖籍汉族人抗原肽处理相关运载体（TAP）等位基因多态性及与类风湿关节炎（RA）的相关性。方法 采用低渗溶血法提取人血白细胞中的DNA，运用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法（其中三个位点的引物采用了错配法）和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对50例RA患者和50例健康对照血样进行TAP等位基因多态性分析，寻找RA易感和抗性相关基因型。结果 TAP2665-A和565-A在RA组显著低于对照组（P=0.000）。RA组TAP2以379-V、687-S、665-T及565-T为主，四种等位基因频率均显著高于对照组（P<0.05）;RA组379-I I（8%）、637-GG（8%）显著低于对照组（P<0.05）。TAP2-665、565在RA组都以纯合子TT（62%、70%）为主，显著高于对照组（P=0.000）;而对照组均以AA（80%、78%）为主，且显著高于RA组（P=0.000）。结论 皖籍汉族人TAP等位基因除具有与其他地方人群共同的多态性特点外，还具有有别于其他地区人种的自身特征。皖籍汉族人存在RA的易感和抗性TAP等位基因。
关键词 抗原肽处理相关运载体 等位基因 类风湿关节炎 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106（2003）16-2401-04
The study on the association between the
polymorphism of human transporters associated with antigen
processing alleles and rheumatoid arthritis.
Shen Chong，Ye Dongqing Zhai Jingxia，et al.
Department of Epidemiological&Bio-statistic，School of Public Health，Nanjing Medical University，Nanjing210029.
【Abstract】 Objective To investigate the relation between the polymorphism of transporter associated with antigen processing（TAP）genes and rheumatoid arthritis（RA）in Anhui Hansman.Methods Genomic DNA was exˉtracted by low permeating hemolysis from leucocyte.The human transporters associated with antigen processing（TAP）alleles polymorphism of50RA patients and50healthy individuals，was defined by polymerase chain reaction-reˉstriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）amplification and polyacrylamidedel electrophoresis.Three sites were amplificated by mismatch amplification mutation assay.Results TAP2alleles frequencies of665-A and565-A in RA group were significantly lower than in control group（P=0.000）and that of379-V，687-S，665-T，565-T were higher in RA than in controlgroup（P<0.05）.As for TAP alleles phenotype frequencies，the hoˉmozygosity for379which is I I（8%）and637-GG（8%），665-AA（24%），565-AA（16%）are associated with reˉsistance to RA（P<0.05or P=0.000），while TAP2-665-TT（62%），565-TT（70%）seems to confer susceptiˉbility for RA（P=0.000）.Conclusion TAP alleles polymorphism in Anhui Han people shows its own characteristics difference from some other race and there is some TAP alleles susceptible or resistant to RA in Anhui Han people.
Key words transporter associated with antigen processing（TAP） alleles phenotype rheumatoid arthritis（RA） polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）
目前国内外有关RA分子生物学研究 ［1～4］ 多集中于HLA-A、DQ及DR区基因的对RA遗传易感性的作用上，而抗原加工呈递相关基因的研究相对较少，本研究着重研究中国汉族人HLA-TAP几个主要 ［4］ 等位基因多态性与RA的关系，以便发现与RA相关的易感基因和抗性基因，从而为RA病因学、诊断学及基础研究提供科学依据。 ˇ 基金项目:安徽省教委自然科学基金（编号:2000J1113）
1 材料与方法
1.1 研究对象 本研究选择皖籍汉人（包括研究个体在内向上三代人均在皖居住的汉族人）作为研究对象。选择合肥某三甲医院已经确诊的50例类风湿关节炎病人（均符合美国风湿病协会1987年制定的RA诊断标准）作为病例组，以同地区体检健康者作为健康对照。两组男女均各为16（32%）、34（68%）例，两组间性别比较差异无显著性（P>0.1）。病例组平均年龄为（45.44±13.59）岁，对照组为（45.32±13.73）岁，两组间差异无显著性（P>0.1）。
1.2 研究方法 抗凝血中白细胞DNA的提取参照文献1。本实验根据限制性内切酶的选择，并参照文献7对TAP2379、565、665及687位点扩增引物进行了错配设计，TAP1333、637位点的引物参考文献9而设计。PCR反应体积为30μl（包括50ng/μl模板DNA2μl，Primer5′、3′各1.5μl，10buffer3μl，100ng/μl dNTP5μl，dH 2 O17μl，Taq酶1U）。反应条件为95℃，2min，1个循环;95℃、1min，52℃、1min，72℃、1min，30个循环;72℃，5min，1个循环。取PCR产物8μl进行限制性酶切。酶切反应体系为20μl，各位点的限制性内切酶及酶切反应条件分别为TAP1-333:Sau3AI37℃1～1.5h，65℃灭活10min;TAP1-637:AccI37℃1～1.5h，65℃灭活10min;TAP2-379:BstuI37℃1～1.5h，直接酶切;TAP2-665:MspI37℃1～1.5h，65℃灭活10min;TAP2-565:RsaI37℃1～1.5h，65℃灭活10min;TAP2-687:BfaI60℃1～1.5h，80℃灭活20min。取10μl酶切产物进行聚丙酰胺凝胶电泳分析。将电泳分析结果用EPiData2.0软件输入计算机，用SPSS10.0软件进行统计分析。
2 结果
2.1 非变性聚丙酰胺凝胶电泳分离TAP等位基因结果 见图1。 图1 TAP1-1等位基因Sau 3AI限制性酶切片段分离图谱酶切片段分离结果显示，A、B、C、E均为Val/Ile杂合子（146bp+118bp+74bp）。D、F为Ile/Ile纯合子（118bp+74bp）。
将所扩增的2个TAP1基因的区域及4个TAP2基因的区域分别定义为TAP1-1、TAP1-2、TAP2-1、TAP2-2及TAP2-3。
TAP1-1区域是一个包含第4外显子的长235bp的TAP1基因片段，其编码产物第333氨基酸位点具有二态性（Ile-Val）;Sau3AI酶切分离结果见图1。
TAP1-2区域是一个包括第10外显子的长183bp的TAP1基因片段，其编码产物第637氨基酸位点具有二态性（Asp-Gly）;AccI酶切分离结果见图2。
TAP2-1区域是一个包括第6个外显子的长212bp的TAP2基因片段，其编码产物第379氨基酸位点具有二态性（Val-Ile）;BstuI酶切分离结果见图3。
TAP2-2区域包括一个含第11外显子的长227bp的TAP2基因片段，其编码产物具有第665氨基酸二态性位点（Thr-Ala）和一个687位点（Stop-Glu）二态性位点;MspI与RsaI酶切分离结果分别见图4和图5。 TAP2-3区域包括第9外显子的长155bp的TAP1基因片段，其编码产物的第565氨基酸位点具有二态性（Ala-Thr），BfaI酶切分离结果见图6。
图2 TAP1-2等位基因AccI 限制性酶切片段分离图谱
酶切片段分离结果显示，A均为Asp/Asp纯合子（132bp+51bp）;B为Asp/Gly杂合子（183bp+132bp+51bp）;C为Gly/Gly纯合子（183bp）。
图3 TAP2-1等位基因BstuI 限制性酶切片段分离图谱
酶切片段分离结果显示，A为Val/Ile杂合子（212bp+192bp）;B为纯合子Ile/Ile（212bp）;C为纯合子Val/Val（192bp）。
图4 TAP2-2等位基因MspI 限制性酶切片段分离图谱
酶切片段分离结果显示，A为纯合子Ala/Ala（227bp）;B为杂合子Thr/Ala（227bp+207bp+20bp）;C为纯合子Thr/Thr（207bp+20bp）。图5 TAP2-2等位基因RsaI 限制性酶切片段分离图谱
酶切产物分离结果显示，A为纯合子Stop/Stop（127bp+88bp+12bp）;B为杂合子Stop/Glu（215bp+127bp+88bp+12bp）;C为纯合子Glu/Glu（215bp+12bp）。图6 TAP2-3等位基因BfaI 限制性酶切片段分离图谱
酶切产物分离结果显示，A为纯合子Thr/Thr（132bp+23bp）;B为纯合子Ala/Ala（155bp）;C为杂合子Thr/Ala（155bp+132bp+23bp）。
